GeneXpert MTB/RIF在结核病诊断及利福平耐药检测中的应用
结核病的诊断，特别是涂阳肺结核和结核病耐药的诊断，主要依据结核病实验室的检测。目前，实验室主要方法有样本涂片抗酸染色和培养，而在肺结核患者中，痰涂片的阳性检出率一般在30%~50%，分离培养阳性率在40%~60%，涂阴肺结核患者占活动性肺结核的73.5%，因此约2/3的患者痰中查不到结核分枝杆菌。缺少细菌学诊断依据易导致临床上存在着误诊误治。结核病的控制难点之一在于确诊的技术耗时较长且敏感性低，对于耐药性结核病尤其是耐多药结核（MDR-TB）诊断的滞后，更导致治疗的延后和结核病的传播。因而寻求快速诊断活动性结核病和耐多药结核病的方法，有助于提高结核的诊断水平。Gene Xpert MTB/RIF技术于2010年12月被WHO批准应用于结核病诊断，因其高度的灵敏度、特异性和操作简便快速而得到广泛关注。本文对其近年应用进展做一综述。
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一、WHO对Gene Xpert MTB/RIF技术的推荐指南
2011年WHO制定了GeneXpert MTB/RIF技术的使用指南，指南中规定首选使用人群为：（1）以明确诊断或疑似结核病，且高度怀疑MDR-TB或为MDR-TB高危人群；次选使用人群为疑似结核病患者是否需要进行Gene Xpert MTB/RIF技术应根据当地的资源及筛查和诊治规范来决定。
（1）以上推荐使用人群的样本为痰液，目前非呼吸道样本的相关资料有限；（2）资源许可地区可进行多次复检，以提高阳性检出率；（4）可应用于儿童。
二、GeneXpert MTB/RIF技术的原理、方法及结果判定
GeneXpert MTB/RIF技术是由美国Cepheid公司研发的一项以结核分枝杆菌核酸扩增为基础的全自动分子诊断方法，是集样本处理、DNA提取、核酸扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测以及利福平耐药基因rpoB突变检测于一体的结核病和耐药结核病快速诊断方法。GeneXpert MTB/RIF试验以全自动半巢式RT-PCR技术为基础、以rpoB基因为靶基因，自动提取DNA后扩增rpoB基因的192bp片段进行检测，同时采用6种分子信标同时检测6种探针，其中5个互相重叠的分子探针（分别以探针A~E命名）选择性覆盖rpoB基因的81 bp核心区，用于检测利福平耐药。研究显示，95%以上的利福平耐药菌株有rpoB基因变异。此外，由于有86%的利福平耐药菌株同时对异烟肼耐药，故利福平耐药在一定程度上可作为MDR-TB的监测指标。
GeneXpert MTB/RIF试验，首先将样本与含氢氧化钠及异丙醇的处理液常规按1∶2比例混合震荡，室温静置15 min，再吸取1 mL混合液转移至反应盒中，置于GeneXpert仪器进行全自动检测，约2h即可读取结果。结果判断依照探针的循环阈值（Ct值），当内对照探针Ct≤38时为阳性。5个探针中至少2个探针Ct≤38即为检测到结核分枝杆菌，可进一步按照Ct值对结核分枝杆菌进行半定量，Ct<16为高含量，Ct为16~22为中等含量，Ct为22~28为低含量，Ct值>28为极低含量。检测利福平耐药的基础在于结核分枝杆菌特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差。即ΔCt值。系统设置的结果判断标准为ΔCt>3.5提示对利福平耐药，ΔCt≤3.5提示对利福平敏感。由于终止循环数为38个循环，因此当早期探针Ct>34.5时或晚期探针Ct值>38时，利福平耐药结果为不确定。
三、GeneXpert MTB/RIF技术在肺结核诊断中的应用
创新诊断技术革新基金会（FIND）发动4个国家（秘鲁、阿塞拜疆、南非和印度）的中心实验室对1 730例疑似结核病患者进行了研究，GeneXpert MTB/RIF试验单次检测561例涂阳患者的灵敏度为98.2%；171例涂阴患者首次、第2份和第3份样本检测的灵敏度分别72.5%、85.1%和90.2%；GeneXpert MTB/RIF对609例非结核病的特异性达99.2%；对利福平药敏结果的准确性达97.6%。西班牙、法国和美国分别开展的3项GeneXpert MTB/RIF试验，多采用患者的呼吸道样本，痰涂片阳性样本的灵敏度为98%~100%，痰涂片阴性样本的灵敏度为57%~83%。这与多中心研究中痰涂片阳性和阴性样本的灵敏度结果（98.2%和72.5%）相一致。
我国GeneXpert MTB/RIF技术于2013年底由全球基金结核病耐多药项目引进，已有诸多研究对GeneXpert MTB/RIF试验与涂片和培养法作对比分析。GeneXpert MTB/RIF诊断肺结核的灵敏度和特异性分别为47.4%~71.67%和96.67%~100%，痰涂片的灵敏度和特异性分别为20%~51.67%和95.1%~97.4%，培养的灵敏度和特异性分别为28%~53.33%和95.1%~100%。以临床诊断为金标准，Gene Xpert MTB/RIF试验肺结核的灵敏度为58.8%~100%，涂片法的灵敏度为25.68%~85.7%，培养法的灵敏度为51.44%~99.0%。以培养结果为金标准，GeneXpert MTB/RIF试验的灵敏度和特异性分别为93.7%~96.9%和87.5%~97.92%。以比例法药敏结果作为金标准，GeneXpert MTB/RIF试验的灵敏度和特异性分别为86.8%~97.73%和95.3%~97.6%。GeneXpert MTB/RIF检测在痰样本中的灵敏度和特异性均显著高于传统方法涂片和培养法，且未发现与非结核分枝杆菌有交叉反应。
四、GeneXpert MTB/RIF技术在涂阴肺结核诊断中的应用
涂阴肺结核为3次痰涂片及1次痰培养结核分枝杆菌均阴性的肺结核。目前已知痰涂片检测的灵敏度为>10 000 CFU/mL痰液，培养的灵敏度为10~100 CFU/mL痰液。国内外均报道GenXpert MTB/RIF试验的优势在于能检测出结核分枝杆菌含量较低的样本。据报道临床结核病患者结核分枝杆菌培养阴性的样本在GeneXpert MTB/RIF试验中结果却为阳性，且Ct均>22，即样本中含菌量很低。国内报道，126例菌阴肺结核患者的晨痰采用GeneXpert MTB/RIF试验进行检测阳性率较培养法提高了27.8% 。92份结核分枝杆菌培养阴性支气管灌洗液样本，经Genexpert MTB/RIF试验阳性率为38.0%（35/92），显著高于痰样本。
五、GeneXpert MTB/RIF技术在其他结核病诊断中的应用
1．结核性胸膜炎
国内文献报道结核性胸膜炎胸腔积液涂片法和培养法阳性率分别为1.5%~14.9%和3.0%~21.2%，特异性为96.7%~100%，而GeneXpert MTB/RIF试验的阳性率为16.4%~81.1%，特异性为92.86%~100%。可见GeneXpert MTB/RIF试验诊断结核性胸膜炎的阳性率结果相差较大，但特异性均较高。也有报道，由于结核性胸水多为刺激产生，含有结核分枝杆菌的胸水很少，GeneXpert MTB/RIF试验应用在胸水检测中阳性率低，对结核性胸膜炎的诊断意义有限。国外报道GeneXpert MTB/RIF试验诊断结核性胸膜炎的灵敏度和特异性均较高。上述结果表明，GeneXpert MTB/RIF试验对诊断结核性胸膜炎具有一定价值，但由于报道中各研究的样本量不同，结果差异较大，有待进一步深入研究。
2．其他肺外结核
肺外结核样本包括脑脊液、关节腔积液、尿液和脓液等。文献报道，GeneXpert MTB/RIF试验检测各种样本的灵敏度粪便与尿液均为100%，胃液为87.5%，组织样本仅为69%。有研究以临床综合诊断作为诊断肺外结核病的金标准，则GeneXpert MTB/RIF试验的总体灵敏度和特异性分别为80.6%和99.6%，其中检测关节腔积液、心包积液和腹水样本的灵敏度均为100%；检测脓液、细针穿刺样本、组织及淋巴结的灵敏度依次为95%、86%和73%，检测脑脊液的灵敏度最低（29%），而检测各种样本的特异性均高于97%。国内研究显示，33例淋巴结结核样本涂片镜检法、结核分枝杆菌培养法和GeneXpert MTB/RIF试验阳性率分别为24.2%（8/33）、36.4%（11/33）和87.9%（29/33）；23例脊柱结核样本阳性率分别为26.1%（6/23）、30.4%（7/23）和82.6%（19/23），21例肾结核样本阳性率分别为4.8%（1/21）、14.3%（3/21）和42.9%（9/21）；24例结核性脑膜炎样本涂片镜检法均为阴性，其培养法和GeneXpert MTB/RIF试验阳性率分别为4.2%（1/24）和12.5%（3/24）。140份脊柱结核临床样本，GeneXpertMTB/RIF试验结核分枝杆菌阳性检出率为63.57%，在64份培养阳性样本中，Gene Xpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌的灵敏度为98.44%（63/64），在76份培养阴性样本中，GeneXpert MTB/RIF试验检测结核分枝杆菌的灵敏度为34.21%（26/76）。浅表淋巴结结核32例样本中，GeneXpert MTB/RIF试验检测为阳性率78.1%，培养阳性率为3.1%。肺外结核的确诊是临床的难点，与肺外结核临床样本均存在取材困难、异质性大、含菌量少以及前处理难度大等特点有关，GeneXpert MTB/RIF技术应用于肺外结核的诊断，是一种有益的尝试。
六、GeneXpert MTB/RIF技术在MDR-TB诊断中的应用
利福平药敏试验有常规法、BACTECTM MGITTM960和基因芯片法等，上述方法均耗时长，操作繁琐，GeneXpert MTB/RIF技术不仅检测结核分枝杆菌，同时检测利福平耐药情况。国内许多资料表明，以常规药敏试验为检测利福平耐药的金标准，GeneXpert MTB/RIF的灵敏度和特异性分别为86.8%~100%和95.3%~100%。国外研究结果，以常规药敏试验为检测利福平耐药的金标准，Gene Xpert MTB/RIF试验能正确鉴定出97.6%（200/205）利福平耐药菌株，也能准确排除98.1%（504/514）的利福平敏感样本。Chang等系统综述总结了GeneXpert MTB/RIF对利福平耐药的灵敏度和特异性分别为94.1%和97.0%。但也有报道称，Gene Xpert MTB/RIF试验检测利福平耐药时可出现假阳性结果。因此WHO建议临床上用GeneXpert MTB/RIF试验检测到利福平耐药后，先进行药物治疗，同时行常规药敏试验以验证GeneXpert MTB/RIF试验结果。我国在GeneXpert MTB/RIF技术和传统（或液体）药敏试验联用的诊断流程中建议，第1次Gene Xpert MTB/RIF检测为利福平耐药时，必须采集第2份涂阳样本进行复查，以第2次样本复检结果为准。
七、问题与展望
目前，许多国家已经开展了GeneXpert MTB/RIF技术检测法，但有以下问题需要解决，特别在发展中国家：（3）对儿童结核病、肺外结核诊断价值有待于进一步研究；（4）仪器和试剂较为昂贵，在基层推广有一定的难度；（5）检测项目的收费标准和新农合报销在短期内较难落实，影响其广泛使用。但该试验方法具有快速、操作简单、交叉污染少，灵敏度和特异性较高，且能同时检测利福平耐药情况，并当样本涂片阳性而GeneXpert MTB/RIF检测阴性时，可初步判定为非结核分枝杆菌等优点，有助于临床上早期快速诊断和鉴别诊断结核病，从而使患者得到及时治疗。GeneXpert MTB/RIF技术监测传染性肺结核转归优于痰涂片法，建议将其引进现代结核病控制策略中，要切实加大对结核病防治工作的投入，加强耐药结核病的控制。
引用: 陈子芳, 周广信. GeneXpert MTB/RIF在结核病诊断及利福平耐药检测中的应用 [J] . 国际流行病学传染病学杂志,2017,44 (6): 420-424.书籍广告
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