肺隐球菌病临床诊疗

基于荚膜多糖的抗原性,上述两种主要隐球菌的血清型分为A型、B型、C型、D型及AD型;新生隐球菌分为格鲁比变种(Cryptococcus neoformans variety grubii,A血清型)、新生变种(Cryptococcus neoformans variety neoforman,D血清型)、混合变种(AD血清型)。

格特隐球菌血清型主要为B型和C型。

新生隐球菌的基因型包括VNⅠ、VNBⅠ、VNⅡ、VNBⅡ、VNⅢ和VNⅣ;格特隐球菌的基因型包括VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ、VGⅣ、VGⅤ和VGⅥ,其中VGV和VGVI分别于2019年和2022年被报道^[7-8]。血清型、基因型及种类间的关系见表1^[9]。

国内外研究数据显示,临床分离的隐球菌菌株中,90%为新生隐球菌格鲁比变种,且A型为临床主要流行血清型,VNI是最常见的基因型。

格特隐球菌感染在我国多为散发,我国患者感染的格特隐球菌最常见的是VGI型菌株^[910-11]。

既往有学者发现,VGⅠ、VGⅡ、VGⅢ和VGⅣ菌株中,VGⅡ菌株对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑最不敏感,而VGⅠ菌株对氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑最敏感^[12]。这些信息表明,对感染的隐球菌菌株进行快速精细的分子鉴定可以帮助指导临床治疗策略。

二、流行病学与风险因素

了解PC的流行病学特征对该病的防控及诊治具有重要意义。国外研究显示,PC的发病率从1999年至2006年上升了6倍,达到4/10万,增加的患者大多数为非HIV感染者^[13]。国外调查结果显示,隐球菌病患者中非HIV宿主的比例低于35%^[14-15]。与国外的研究结果相比,国内隐球菌病患者中非HIV宿主所占比例更高^[11]。2021年,有学者纳入国内多家医院PC患者(457例),其中87.75%的患者无已知免疫缺陷。中国免疫功能正常人群更容易罹患隐球菌病,考虑可能与编码甘露糖结合凝集素的基因缺陷、Fc-γ受体2B基因遗传多态性、模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR)和Dectin-2的基因多态性相关^[11,16]。

感染隐球菌的风险因素有:合并HIV感染,尤其是CD4⁺T淋巴细胞计数<100个/μl的患者,实体器官移植的患者,长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、化疗药物的患者,以及合并失代偿性肝硬化、2型糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病、慢性肾脏疾病及抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(抗GM-CSF)自身抗体阳性的患者^[9]。

近期研究发现,抗GM-CSF自身抗体阳性的患者对格特隐球菌更易感,更易进展为肺肿块(>3cm)病变;抗GM-CSF自身抗体阳性的隐球菌脑膜炎患者与较低的1年生存率相关^[17],但其中的机制目前尚不明确,有待进一步探讨。

三、临床表现

PC患者的临床症状缺乏特异性,严重程度与机体免疫状态具有相关性。

无免疫缺陷的PC患者最常见的临床表现为咳嗽、咳痰、发热、胸痛,部分患者可表现为呼吸困难、咯血等^[2,16,18]。其中,25%~40%的患者是无任何症状的^[2,16,19],常由于体检或因其他疾病就诊过程中,在胸部影像学检查中偶然发现。

免疫功能缺陷的患者易出现发热、急性呼吸衰竭等表现,病灶更易播散至肺外,一旦累及脑部,出现隐球菌脑膜炎,患者预后差,病亡率极高^[12,20]。近期研究表明,在艾滋病患者中,每年约有15.2万人患隐球菌脑膜炎,其中11.2万人最终死亡^[21]。

隐球菌脑膜炎若无法得到及时有效的治疗,病亡率可高达100%^[22]。因此,早期诊治PC对于改善患者预后至关重要。

四、诊断方法

由于PC患者的临床表现缺乏特异性,容易被误诊为肿瘤、结核病、病毒性肺炎、细菌性肺炎及其他真菌性肺炎,早期准确诊断比较困难。血液学检查、放射学检查结果是早期了解疾病性质和程度的关键。PC的确诊主要依赖于组织病理学、基于培养的方法和特异性隐球菌抗原(cryptococcal antigen,CrAg)检测,笔者所在团队也进行过经皮肺穿刺活检组织快速现场评价(rapid on site evaluation,ROSE)诊断PC的小样本量研究报道。通过分子生物学方法检测隐球菌特异性核酸序列的敏感度和特异度高,但存在对设备和技术人员专业要求高及费用高等问题,多用于科研,临床应用较少。由于既往暴露于隐球菌的人群也可出现抗体检测阳性结果,故隐球菌抗体检测较少应用于临床,但其在流行病学调查中可提供一定价值。

1.血液学检查:

隐球菌感染患者血液学检测一般无特异性,很难与病毒、细菌感染相鉴别。

白细胞计数可正常、降低或轻度增高,C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)及血红细胞沉降率均可升高。有研究发现,免疫功能正常或轻中度低下的患者,平均白细胞计数、CRP、PCT均处于正常范围;免疫功能重度低下的人群CRP、PCT可略升高,淋巴细胞计数低于免疫功能正常或轻中度低下的患者^[18]。因此,在炎症指标正常时,不能排除隐球菌感染;隐球菌病患者出现炎症指标明显升高时,需警惕是否合并其他感染。

此外,由于隐球菌细胞壁没有1,3-β-D-葡聚糖抗原,而荚膜含有与半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)呈交叉反应的表位,隐球菌感染时可出现血清G试验阴性、GM试验假阳性的结果。

故在临床诊疗过程中,GM试验阳性时,除了考虑常见的可导致该试验阳性的真菌如曲霉菌外,也需警惕隐球菌感染,建议结合患者的病史及其他辅助检查结果进一步明确诊断。

2.影像学表现:

PC的影像学表现多变,主要取决于宿主的免疫功能。

PC基本影像学形态包括单发结节/肿块型、多发结节/肿块型、斑片浸润型、粟粒型和淋巴结肿大型(图1, 2, 3, 4, 5),后两者较少见^[19,23]。其中,结节/肿块型是PC患者最常见的CT表现^[16,24 -25]。

免疫功能正常者主要表现为单发/多发结节肿块影;免疫功能抑制的患者肺部易出现渗出性改变,呈现更广泛多变的影像学表现,以多发结节/肿块型、斑片浸润型为常见类型。

粟粒型较为罕见,易误诊为粟粒型肺结核,常出现在免疫功能抑制患者中。

淋巴结肿大型在成年PC患者中少见,但儿童PC患者多伴有全身多组淋巴结肿大,考虑为儿童免疫功能尚未发育完全导致病原体沿淋巴管播散所致^[26]。

PC病灶多位于双肺下叶胸膜下,可伴有支气管充气征、晕征、胸膜增厚、胸膜牵拉、分叶(浅分叶多见)和毛刺(多位于晕中,较纤细),胸腔积液、肺门/纵隔淋巴结肿大、空洞(腔内多有间隔)及钙化少见^[27-28]。

肺结核好发于上叶尖后段及下叶背段,病灶可有钙化,空洞腔内较干净,无间隔,周围可见树芽征、卫星灶,晕征少见;肺癌患者病灶可见深分叶、短毛刺征、空泡征等。同时,肺结核和肺癌也是临床上导致胸腔积液及肺门/纵隔淋巴结肿大的重要原因,而PC患者胸腔积液及肺门/纵隔淋巴结肿大均少见,这些影像表现可为PC与肺结核/肿瘤鉴别提供依据。

PC病灶在增强CT扫描下可呈现均匀强化^[4,28]。在正电子发射计算机断层显像(PET-CT)上PC病灶可显示为高代谢,容易被误诊为肺癌或结核瘤^[29]。因此,在临床诊疗过程中不能过分依赖于增强CT或PET-CT,需结合患者病史及其他辅助检查明确诊断,避免患者因误诊遭受不必要的手术创伤。

3.病原学涂片及培养:

病原学检查是诊断PC的重要依据,其中墨汁染色是快速鉴定隐球菌的方式之一,光学显微镜下可见隐球菌酵母细胞周围有一圈透亮的荚膜(图6)。

对于PC患者,可收集其痰液、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)等标本直接涂片进行墨汁染色镜检,但检出率极低;对于并发隐球菌脑膜炎的患者,其中非HIV感染患者脑脊液墨汁染色敏感度为30%~50%,HIV感染者敏感度可达80%^[30]。

培养法是确定隐球菌感染的“金标准”,但该方法耗时长,需要在30~35℃条件下培养2~3d,若患者进行过抗真菌治疗,需进一步延长培养时间,但检出率较低,痰培养阳性率一般低于25%。合并HIV感染的隐球菌脑膜炎患者,血培养及脑脊液培养的阳性率高达70%和90%以上^[31]。因此,怀疑隐球菌感染播散至脑部的患者,应尽早将脑脊液送检。

4.隐球菌荚膜抗原(CrAg)检测:

CrAg检测是基于抗体-抗原相互作用诊断隐球菌感染的重要方法,可用于血液、BALF、脑脊液、尿液等标本的检测,主要有酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、乳胶凝集试验(latex agglutination,LA)和胶体金法(lateral flow assay, LFA)。

标本储存不当、隐球菌负荷量低、隐球菌缺失荚膜抗原、钩状效应(即HOOK效应,抗原抗体比例不合适所致)等情况可导致CrAg出现假阴性;毛孢子菌、黏滑口腔球菌、玉米黑粉菌感染或类风湿因子阳性时可出现CrAg假阳性结果^[32]。

LA用于检测非HIV感染的PC患者,BALF的敏感度为82.6%,血清的敏感度为73.9%,检测两种标本的特异度均在95%以上^[33]。因此,BALF的抗原筛查有助于PC的早期诊断。

通常情况下,PC病灶局限的患者血CrAg常为阴性,故当此类患者CrAg检测阳性,抗原滴度高时需警惕肺外播散,建议完善腰椎穿刺及颅脑核磁排查有无隐球菌脑膜炎。

由于LA及ELISA对实验室要求较高,故其使用受到了一定的限制。

LFA是一种简单、即时、准确、性价比高的检测手段(图7,8)。其检测结果和LA、ELISA具有高度的一致性。

LFA较另外两种CrAg检测方法,在检测格特隐球菌抗原时具有明显的优势;对于非HIV感染的PC患者,LFA的敏感度显著高于LA(90.9% vs. 23.5%,P<0.001)^[343536-37]。

但CrAg不能区分新生隐球菌和格特隐球菌,实验室可采用刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝琼脂(CGB培养基)接种鉴别格特隐球菌和新生隐球菌;新生隐球菌在CGB培养基上生长时,通常会使菌落周围培养基的颜色变为蓝色,而格特隐球菌则不会引起这种颜色的变化。

5.病理组织学检查:

采自无菌部位的标本,病原学涂片或培养结果为阳性;组织病理检查发现隐球菌均可确诊PC,但培养阳性率较低且耗时长。

由于PC患者病灶多位于肺外周带,故目前经皮肺穿刺活检是最常用的取检手段。

组织标本除常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色外,还可以通过过碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)、六胺银(Gomori’s methenamine-silver,GMS)、黏液卡红(mucicarmine,MC)和奥尔辛蓝(alcian blue,AB)染色显示菌体或荚膜。

HE染色菌体呈无色,组织细胞内可见空泡状透亮小体;PAS染色可见隐球菌荚膜染成紫红色;GMS染色菌体壁呈黑色;MC染色后,隐球菌的荚膜会呈现出红色或粉红色;AB染色菌体呈蓝色。以上染色结果有助于提高诊断的准确率。

值得注意的是,笔者所在团队在观察隐球菌病理切片的过程中,发现新生隐球菌(HE染色,图9)和格特隐球菌(HE染色,图10)镜下表现有所差异。格特隐球菌外部有一层物质,似为黏液,其具体性质需进一步研究;而新生隐球菌在镜下无类似的表现。这一镜下表现差异,是否能作为新生隐球菌和格特隐球菌的初步鉴别,有待进一步探究。

6. ROSE技术:

ROSE是在临床操作过程中,对所采集的标本(呼吸系统疾病标本包括痰液、BALF、刷片、气管镜活检标本及经皮肺穿刺标本)现场进行快速制片和染色,对其中的细胞学和微生物学内容做出迅速判断的技术^[38]。

由于支气管镜、经皮肺穿刺活检等技术的迅速发展,ROSE已成为临床诊断不可或缺的一部分,其诊断肺癌的敏感度和特异度均较高,尤其是在诊断小细胞肺癌时,与病理诊断的符合率高达99.2%^[39]。

ROSE所见新型隐球菌肺炎的特征为:多核巨细胞包浆内、外可见较多圆形或椭圆形、直径4~20μm的菌体,外有一圈透明的肥厚荚膜,其内可见1个或多个着色颗粒(图11,12)。

但目前关于ROSE诊断PC的报道很少,笔者所在团队曾对比56例经病理确诊的未合并HIV感染的PC患者,经皮肺穿刺活检组织的ROSE、LFA、组织病理学及组织培养的敏感度分别为89.3%、53.6%、91.1%和61.5%。ROSE、LFA、组织病理学和组织培养诊断PC的平均时间分别为(8.3±0.9)min、(9.8±2.2)min、(75.4±3.5)h和(78.7±27)h^[40]。

ROSE在这56例患者中未造成误诊,但有6例患者出现漏诊,笔者考虑经皮肺穿刺活检组织ROSE诊断PC造成漏诊的主要原因为:

(1)经皮肺穿刺组织在印片或者涂片过程中,如带有病变的组织成分较少时,涂抹不均匀或者没有涂抹上病变组织成分;

(2)组织细胞过多,隐球菌隐藏在细胞中不易被发现;以上情况就会导致漏诊。

这些数据初步说明了ROSE临床诊断PC具有良好的准确性及时效性,需扩大样本量进一步研究。

笔者认为将ROSE推广于临床诊断PC,有利于缩短确诊时间,为患者的早期治疗赢得时间。但目前ROSE应用于肺泡灌洗液、痰液等标本诊断PC的数据资料尚缺乏,值得进一步探索。

7.分子生物学技术:

近年来,分子生物学技术在隐球菌分类、基因分型和诊断等研究中发展迅速,在PCR体系中加入隐球菌的特异性引物,可直接对血液、脑脊液、BALF及组织等样本中的隐球菌进行鉴定。

包括巢氏PCR、多重PCR、恒温扩增PCR、DNA指纹分类法、基于探针的微阵列法及实时荧光定量PCR等技术,它们多以隐球菌内转录间隔区序列为靶标。

当表型方法鉴定结果不明确时,还可以采用DNA测序法获得核酸序列进行比对来鉴定菌种^{[31323334353637383940-41]}。

宏基因组二代测序(mNGS)等分子生物学技术已成熟应用于临床样本检测。mNGS可在1次检测中识别几乎所有潜在的病原体(病毒、细菌、真菌和寄生虫等),不仅可以鉴别新生隐球菌和格特隐球菌,还可以辅助鉴别隐球菌不同亚型之间病理和表型的差异等。

对常规检测手段无法明确诊断或经验性抗感染治疗无效的患者,mNGS具有一定的优势。

但因真菌破壁技术等客观原因,mNGS用于诊断PC的敏感度有待进一步提高。而且,这些方法只能判定送检标本中有无隐球菌存在,而无法判断是活菌还是死菌,是否为致病菌,因此无法完全替代传统培养方法。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是基于蛋白对菌种进行鉴别。与传统的扩增片段长度多态性、多位点序列分型法相比较,MALDI-TOF MS能很好地区分隐球菌及其不同的血清型和分子型,并能大幅缩短鉴定时间^[41]。

五、治疗

所有PC患者均应仔细评估免疫功能情况。

在免疫功能低下的患者中,注意完善血培养和腰椎穿刺来明确有无隐球菌血症及隐球菌脑膜炎。治疗将根据患者的免疫功能、是否累及中枢神经系统、有无隐球菌血症及病情的严重程度决定。因此,无症状的免疫功能正常的PC患者,建议可密切观察或使用氟康唑200~400mg/d,疗程为6个月^[10]。

由于既往有免疫功能正常、肺部病灶局限的患者出现感染播散的情况,故若无用药禁忌证,笔者建议采用药物治疗而非随访观察,避免造成不良后果;轻至中度PC的定义是没有弥漫性肺浸润和没有播散到其他解剖部位,病情严重指存在肺部多发病灶,弥漫性肺浸润和(或)播散到包括中枢神经系统在内的其他部位^[9]。

有轻中度症状的患者,推荐使用氟康唑400mg/d,疗程6~12个月;对于肺部严重受累、乳胶凝集法测得血液隐球菌抗原滴度大于1∶512(但目前国内多数医院尚缺乏隐球菌抗原滴度检测,建议积极开展,可为治疗决策提供依据),则应按照隐球菌脑膜炎治疗要求进行,包括诱导治疗、巩固治疗和维持治疗。

2021年,朱利平和翁心华^[42]建议非艾滋病的隐球菌脑膜炎患者,在诱导期,建议两性霉素B采用低剂量(<0.7mg/kg)、长疗程(2~3个月),治疗至少≥4周,以降低其不良反应并获得较好疗效。

目前,最新全球隐球菌诊治指南推荐:

诱导期首选两性霉素B脂质体,剂量为3~4mg·kg^-1·d^-1,联合5-氟胞嘧啶25mg·kg^-1·次^-1,4次/d,疗程至少2周;

巩固期使用氟康唑400~800mg/d,疗程8周;

维持期使用氟康唑200mg/d,疗程12个月^[12,43]。

免疫功能受到抑制的无症状、轻中度症状的PC患者,建议使用氟康唑400mg/d,疗程6~12个月。有重度症状的患者,治疗方案参照隐球菌脑膜炎的原则。

既往国内推荐合并HIV感染者诱导期首选方案为两性霉素B 0.5~0.7mg·kg^-1·d^-1,联合5-氟胞嘧啶100mg·kg^-1·d^-1,疗程≥4周^[44]。